广州百仕肽生物科技有限公司企业标准
纳吐素抑菌活性的测定——琼脂平板扩散法
Determination of Antimicrobial Activity in Natucin ——Agar Diffusion Method
1. 范围
本标准规定了琼脂平板扩散法测定抗菌肽制剂——纳吐素(Natucin)中的抗菌肽抑菌活性的原理、试剂和材料、仪器、操作步骤、结果计算、精密度和测试报告。
本标准仅适用于测定广州百仕肽生物科技有限公司的抗菌肽制剂——纳吐素中的抗菌肽抑菌活性。
2. 原理
纳吐素中的抗菌肽对生长于琼脂平板培养基上的细菌生长具抑制作用，而在琼脂板上形成透明的抑菌圈。在本标准规定的操作条件下，抗菌肽抑菌圈的直径（D）与肽浓度（M，μg/ml）之间具有如下线性关系：lnM = 0.015D2 + 8。因此，点样肽液的抑菌活性浓度(AAC)（Arbitrary Units，AU/ml）可以如下公式计算：AAC （AU/ml）= 3000eY （Y = 0.015D2）。
3. 安全细则
与普通微生物实验室的要求一样。特别要注意，当用沸水加热琼脂时，手要戴上绝热性较好的手套；勿将脸凑到沸水浴箱面上，以免被烫伤。
4. 试剂和材料
4.1 指示菌 大肠杆菌(Ecoli K12D31)。
4.2硫酸链霉素，MW1457.38，纯度99%(广州市齐云生物科技有限公司)。
4.3 MH肉汤粉，BR(广东环凯微生物科技有限公司)。
4.4 MH琼脂，BR(广东环凯微生物科技有限公司)。
4.5 MH肉汤，按说明要求配制，调pH = 7.0，高压灭菌20分钟后备用。
4.6 MH固体培养基：取3.8克MH琼脂，溶于100mL水，调pH = 7.0，高压灭菌20分钟后备用。
4.7 MH固体平板 按6.3制备，等培养基于室温条件下凝固后置于4℃冰箱中保存备用。
4.8 酒精(65%)。
4.9 打孔器，不锈钢材质园管，材厚0.2mm，外径3.0mm，长100 mm。
4.10 玻璃培养皿，外径(内径)为90(85)或180(173.8)或200(195) mm。
5．仪器
5.1 电子天平，TE124S，±0.0001克(德国赛多利斯)。
5.2 高压蒸汽灭菌锅(日本Hirayama)。
5.3 超净工作台，SW-CJ-1F/1FD(苏州苏净集团苏净安泰公司生产)。
5.4 酸度计，PB10(德国赛多利斯)。
5.5气浴恒温振荡器，往复式CHA-SA(常州普天仪器制造有限公司)。
5.6 可见分光光度计，V-1200(上海美谱达仪器有限公司)。
5.7 隔水式恒温培养箱，GHP9080 (上海恒一科学仪器有限公司生产)。
5.8 水浴锅，HWS-12 (上海恒一科学仪器有限公司生产)。
5.9 超声波清洗机，VTG-2000 (深圳市固特超声医疗设备有限公司)。
5.10其它 接种环、酒精灯、刻度吸管和游标卡尺等。
6. 操作步骤
6.1 纳吐素抗菌肽提取
取0.2500g纳吐素预混剂，装于试管中，加入2 ml 65%酒精，以超声波仪处理20分钟；离心 (4000rpm, 10min)，上清液保存于4℃备用，按后续步骤检测提取液的抑菌活性。
6.2 对数期指示菌制备
将耐受链霉素的大肠杆菌突变株（K12D31）的甘油冻存液划线于MH平板（内径85mm）上，将平板倒置，放入37℃培养箱中培养至平板上生长有明显的菌落。挑一菌落于10 ml的MH肉汤培养基(含50μg/ml链霉素)中，置于恒温摇床37℃振荡培养，培养至其OD600nm = 0.5（以液体MH肉汤作空白）。
6.3 含指示菌的MH培养平板的制备
一定量(如200ml)的熔融MH固体培养基置于50℃水浴中保温至温度恒定，加入500μl对数期指标菌液，混匀。取其中24ml含菌培养基倒入内径85mm的培养皿中，使固定培养基厚度达4.22mm(对内径为173.8mm的培养皿，应加入100ml含菌培养基；对内径为195mm的培养皿，应加入126ml含菌培养基)。等培养基凝固，立即以3mm打孔器在培养基平板上均匀分布地打上数个孔（打孔数应为分析样品数的3倍）。
6.4 肽液点样和细菌培养
对于一个待测样液，吸取3份液（每份10μl）点样于含指示菌的培养平板孔中，并立即置于4℃冰箱中静置6h以让肽液渗入琼脂中，后倒置于37℃培养箱中培养，培养至第24h时测定每一个抑菌圈的直径（mm）。
7. 结果计算
对于待测肽液，抑菌活性按（1）式计算：
AAC试液(AU/ml) = 3000eY ，其中Y = 0.015D2 （1）
对于待测预混剂，抑菌活性按（2）式计算：
AAC预混剂(AU/g) = (2/0.25)╳A试液 = 8╳A试液 （2）
例如，当D = 9 mm时，则Y = 1.215，A试液 =10110 AU/ml， AAC预混剂 = 8╳10110 = 80770 AU/g。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留至整数。
8. 检测报告
按表A。
表A 纳吐素抗菌活性含量测定结果报告
检测日期（年/月/日）： 检测人：
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抑菌圈直径D, mm
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纳吐素抑菌活性, AU/g
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1
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2
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3
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1
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2
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3
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平均值
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变异系数, %
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审核人： 质检部盖章
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